Ezio Auditore é um nobre de Florença, descendente de Altaïr, e trará para a franquia uma série de modificações. Entre as principais estão nadar e voar (sim, voar), sendo que para esta segunda o protagonista utilizará nada menos que a máquina voadora de Leonardo Da Vinci, uma espécie de avó da asa-delta.
Outras mudanças interessantes são a variedade das armas, que aumenta consideravelmente, liberando machados, outras espadas, lanças, duas lâminas escondidas e muitas outras armas. O jogo se passa em Florença e outras cidades vizinhas.
